Resumo

O estudo da diversidade genética de bactérias diazotróficas, ou seja, fixadoras de nitrogênio, pertencentes ao gênero Azospirillum associadas a raízes de pastagens nativas do Pantanal Sul-Mato-Grossense, possibilita conhecer a população de diferentes tipos de bactérias e assim aplicar técnicas sustentáveis no melhoramento de pastagens, principalmente de nativas. Uma das utilizações da técnica de ARDRA (Análise de restrição do DNA ribossomal amplificado) é na identificação e agrupamento de isolados de espécies diferentes. A análise foi feita em 25 bactérias, mais duas estirpes tipo de Azospirillum brasilense (BR11001) e Azospirillum lipoferum (BR11080), usadas para posterior comparação dos perfis de restrição dos isolados caracterizados morfologicamente como pertencentes ao gênero Azospirillum. Para a extração de DNA bacteriano, as bactérias foram submetidas a um crescimento de 48 horas em meio líquido DYGS, e posteriormente, realizou-se a extração do DNA utilizando kit de extração PureLinkTM Genomic DNA (Invitrogen), seguindo o protocolo recomendado no produto. Para reação de PCR (reação em cadeia da polimerase) utilizou-se iniciadores específicos para o gene 16S DNAr , Y1(5`- TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC –3`) e Y3 (5`- CTAGACCCCACTTCAGCATTGTTCCAT –3`) cujo o produto amplificado é de 1450 pares de base. A reação de amplificação para um volume de reação de 50 uL foi feita utilizando tampão de enzima 1X em relação ao volume de reação, 2,0 mM de MgCl2, 200µM de dNTP, 0,12 µM de primer Y1 e de primer Y2, 1,0 U de Taq DNA polimerase (Ludwig). As condições de reação foram: 1 etapa inicial de desnaturação ( 93°C por 2 minutos), seguido por 35 ciclos intermediários (93°C por 45 segundos, 62°C por 45 segundos, 72°C por 2 minutos) e 1 etapa final de extensão a 72°C por 5 minutos. O amplicon resultante foi clivado com as enzimas de restrição Alu I e Rsa I. Através das análises feitas através de uma matriz de similaridade tipo 1, utilizando o coeficiente Jaccard, tivemos os seguintes resultados: os isolados tem 63% de diferença com relação as estirpes-padrão (Azospirillum brasilense e A. lipoferum) e são parecidos entre si em 80%. Formam três grupos que se diferenciam entre si em 80%. O primeiro grupo apresenta 100% de similaridade entre si e contém 25 isolados, porém nesse grupo há 2 isolados que formam um grupo que difere dos demais em 10%. O segundo subgrupo é formado pelo isolado AZM 15 que é distinto do primeiro em apenas 5%. Já o terceiro grupo é formado por três isolados, dois com 100% de similaridade entre os isolados HAI51 e HRI48, e a HAI6 que se distinguiu dos dois anteriores em aproximadamente 3%. Há pouca similaridade entre os isolados, porém a técnica permitiu agrupar em grupos distintos.